在植物科學領域，解析轉錄因子與DNA的互作機制是構建基因表達調控網絡的核心，更是揭示植物生長發育、逆境適應等生命過程分子機制的關鍵。傳統的ChIP-seq技術依賴高質量特異性抗體，這一局限性使非模式植物的研究面臨巨大挑戰。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA親和純化測序）技術的出現，為研究模式和非模式植物的轉錄調控研究提供了高效、精準的解決方案。本文將系統解析三種基于DAP-seq的轉錄調控研究思路，以期為相關領域的科研工作者提供有益的思路與啟發。
一、技術介紹
（一）核心原理
DAP-seq通過體外表達出含有標簽（如His、Halo標簽）的目的蛋白，利用標簽特異性配體純化蛋白，再與基因組DNA片段孵育結合，然后富集與目的蛋白結合的DNA，經高通量測序及生物信息學分析，在全基因組范圍內鑒定轉錄因子的結合位點（TFBS）。該技術無需目的蛋白特異性抗體，無需轉基因材料，即可揭示轉錄因子與DNA的互作網絡。
（二）藍景科信DAP-seq技術路線圖
（三）技術優勢
自2016年在《Cell》發表，2017年《Nature Protocols》發布標準化實驗方法以來，DAP-seq迅速成為解析轉錄因子調控機制的關鍵技術。截至目前，藍景科信使用該技術，已助力科學家在植物生長發育、逆境脅迫響應、果實發育、系統進化等多個研究方向取得突破，相關研究成果發表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等期刊。
二、三大實用研究思路與藍景科信案例解析
（一）研究思路一：DAP-seq + 下游驗證——精準鎖定靶基因調控關系
該思路以 “全基因組篩選 + 靶向驗證" 為核心，先通過DAP-seq定位轉錄因子結合位點，結合RNA-seq篩選差異表達靶基因，再經體外與體內實驗驗證直接調控關系，是最基礎且高效的研究框架。這是DAP-seq最基礎且高效的研究框架，通過“全基因組篩選+靶向驗證"的流程，明確轉錄因子與靶基因的直接調控關系。
篩選階段：利用DAP-seq定位轉錄因子的全基因組結合位點，結合RNA-seq篩選基因表達差異顯著的靶標，通過聯合分析縮小核心調控基因范圍。
驗證階段：體外通過EMSA（凝膠遷移實驗）、Y1H（酵母單雜）驗證蛋白與DNA的特異性結合，體內通過ChIP-qPCR（染色質免疫共沉淀-實時熒光定量PCR）、Dual-LUC（雙熒光素酶報告基因檢測）確認調控關系。
案例1：紫花苜蓿MsMYB35調控花藥發育研究
文章題目：Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development
發表期刊和時間：The Plant Journal（2025）
技術組合：DAP-seq、RNA-seq、Y1H、Dual-LUC
核心發現：DAP-seq鑒定出14,992個結合峰，其中8,097個高可靠性位點富集于基因間區（62.7%）和啟動子區（16.6%），富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三類保守基序，對應3,647個靶基因；聯合RNA-seq篩選出467個直接調控基因，富集于苯丙烷代謝、茉莉酸（JA）合成、細胞壁重塑（如果膠裂解酶通路）等花藥發育相關通路。酵母單雜交（Y1H）實驗和雙熒光素酶報告實驗（Dual-LUC）證實MsMYB35可結合并激活MsJMT和MsPL基因表達，過表達MsMYB35促進花藥發育，沉默則導致花粉不育，外源MeJA可恢復育性。
科學價值：本研究明確了MsMYB35的核心調控作用，為紫花苜蓿分子育種和雜交制種提供理論支撐。
案例2：軟棗獼猴桃花青素調控機制研究
文章題目：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)
發表期刊和時間：Molecular Horticulture（2025）
技術應用：DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Dual-LUC
核心發現：組裝全紅軟棗獼猴桃染色體水平基因組，通過對不同顏色的軟棗獼猴桃品種進行RNA-seq分析，篩選出花青素抑制因子AaBEE1；DAP-seq鑒定AaBEE1在全基因組范圍內的457個結合峰，靶基因顯著富集于黃酮類生物合成通路，其中LDOX基因與果實顏色緊密相關。通過Y1H、EMSA、ChIP-qPCR和LUC等實驗證實AaBEE1通過結合AaLDOX啟動子的G-box區域抑制其表達，且AaLDOX啟動子的29-bp indel 變異可影響基因表達效率。
研究思路二：DAP-seq + 互作蛋白——解析調控網絡協同機制
在明確靶基因調控關系的基礎上，結合蛋白互作研究可豐富調控網絡的復雜性解析。該思路以DAP-seq和RNA-seq篩選靶基因為核心，整合Y2H、Co-IP、蛋白Pull-down、BiFC等蛋白互作研究技術，揭示轉錄因子與其他蛋白的協同作用模式，深化對調控機制的理解。
蛋白互作研究方法
酵母雙雜交（Y2H）作為經典的蛋白互作研究方法，利用酵母轉錄因子的結構特征，通過觀察酵母在營養缺陷培養基上的生長情況或顯色活性判斷蛋白互作。
免疫共沉淀（Co-IP）可在細胞內天然狀態下捕獲相互作用蛋白，通過WesternBlotting或質譜進行分析。
蛋白Pull down是體外研究蛋白質相互作用的經典方法，基于親和層析原理，將誘餌蛋白與特定標簽形成融合蛋白進行表達純化，進而捕獲并鑒定與之相互作用的蛋白。
雙分子熒光互補（BiFC）則能直觀判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用。
熒光素酶互補實驗（LCI）可通過檢測發光信號強度評估蛋白間相互作用及強度。
案例3：擬南芥雄性育性調控網絡解析
文章標題：A DELLA-ANAC106 reciprocal negative feedback circuit modulates gibberellin homeostasis to regulate male fertility in Arabidopsis
發表期刊和時間：New Phytologist（2025）
技術應用：DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Dual-LUC、Y2H、CO-IP
核心發現：本研究鑒定出NAC轉錄因子ANAC106，它在擬南芥幼嫩花藥中高表達，其過表達或顯性負抑制均會導致絨氈層降解異常（提前或延遲），進而引發雄性不育。借助DAP-seq結合RNA-seq數據分析，研究鎖定ANAC106的直接靶標為GA合成基因GA3ox2/4和分解基因GA2ox1；EMSA與Dual-LUC實驗進一步證實，ANAC106可激活GA3ox2/4的轉錄。通過Y2H和Co-IP顯示ANAC106與4種DELLA蛋白（RGA、GAI等）互作，互作區域為ANAC106的N端，且DELLA蛋白以劑量依賴方式抑制ANAC106活性。二者形成雙向負反饋回路，通過調控GA穩態維持雄性育性。
案例4：番茄果實成熟調控機制研究
文章標題：Protein phosphatase PP2C2 dephosphorylates transcription factor ZAT5 and modulates tomato fruit ripening
發表期刊和時間：Plant Physiology（2025）
技術應用：DAP-seq、RNA-seq、Y1H、EMSA、ChIP-qPCR、Dual-LUC、Y2H、CO-IP、BiFC、LCI、蛋白pull-down
核心發現：SlZAT5負調控番茄果實成熟，DAP-seq結合RNA-seq鑒定到1511個成熟相關靶基因（含SlACS4、SlPL8、SlGRAS38等關鍵基因），經Y1H、Dual-LUC、ChIP-qPCR和EMSA實驗證實SlZAT5可直接結合這些基因啟動子并抑制其表達；。進一步通過Y2H篩選出SlZAT5的互作蛋白SlPP2C2，經BiFC、LCI、蛋白pull-down、Co-IP及亞細胞共定位實驗確認二者在細胞核內相互作用，SlPP2C2通過去磷酸化SlZAT5的Ser-65位點，調控其轉錄抑制活性，進而影響乙烯合成與果實成熟。
研究思路三：DAP-seq+多組學聯用——拓展研究深度與廣度
將DAP-seq與ATAC-seq等多組學技術結合，從DNA結合、染色質可及性、基因表達等多維度解析調控機制，拓展研究的深度與廣度，尤其適用于復雜性狀調控網絡的解析。
案例5：小麥氮高效利用與產量提升機制研究
文章題目：An incoherent feed-forward loop coordinates nitrate uptake and tillering in wheat
發表期刊和時間：Molecular Plant（2025）
技術應用：DAP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、ChIP-qPCR、Y2H、Co-IP、BiFC、Y1H
核心發現：TaNLP3是硝酸鹽響應核心調控因子，與TaLBD38、TaNRT2.1構成非一致性前饋環路；Y2H證實TaNLP3與SWI/SNF染色質重塑復合物互作；ATAC-seq與DAP-seq聯合分析顯示，TaNLP3缺失顯著降低硝酸鹽誘導的染色質可及性，共調控4008個靶基因，參與氮吸收、同化等過程。同時鑒定的優異單倍型（TaNLP3-3BHap2等）為小麥高產高效育種提供遺傳資源。
藍景科信：轉錄調控研究的合作伙伴
藍景科信深耕功能基因組學領域，累計完成260+物種，4000+轉錄因子的實驗項目，憑借高質量的服務，已助力合作客戶在Cell，Science，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Journal of Advanced Research，Plant Cell，PNAS等數十期刊發表高質量研究成果。
我們的核心服務體系涵蓋 DAP-seq及ATAC-seq、RNA-seq等組學技術，同時配套EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Dual-LUC等下游驗證方案，并提供Y2H、Co-IP、蛋白Pull-down等全套蛋白互作服務。打造“組學檢測—功能驗證—互作分析" 一站式轉錄因子研究解決方案，支撐科研工作高效推進！
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